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流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)是七十年代發(fā)展起來的高科學技術,它集計算機模擬計算技術、激光技術、流體力學、細胞化學、細胞免疫學于一體, 同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內部顆粒的性狀,還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內DNA、RNA含量等,可對群體細胞在單細胞水平上進行分析, 在短時間內檢測分析大量細胞,并收集、儲存和處理數據,進行多參數定量分析; 能夠分類收集(分選)某一亞群細胞,分選純度＞95%。在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科廣泛應用。

流式細胞儀(FCM)是八十年代集單克隆抗體、熒光化學、激光、計算機等高技術發(fā)展起來的一種先進儀器，已廣泛應用于免疫學、生物化學、生物學、腫瘤學以及血液學等方面的研究和臨床常規(guī)工作。其中檢測人白細胞表面標志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細胞群和亞群進行精確分類，還能分離純化某一群或亞群細胞。活細胞免疫熒光技術是用于FCM檢測的標本準備，染色后也能在熒光顯微鏡下進行觀察，在某些實驗條件下，活細胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優(yōu)于滴片固定的常規(guī)間接免疫熒光的結果。

流式細胞儀技術，主要是測量群體中單個細胞經適當染色后其成分所發(fā)出的散射光和熒光，經染色的細胞在懸液中以單行流過高強度光源的焦點，當每個細胞經過焦點時，發(fā)出一束散射光/或熒光。它們經過過濾及光鏡系統(tǒng)收集到達一個光電檢測器(光電倍增管或一個固態(tài)裝置)，光檢測器把散射光定量轉化成電信號，經數字轉換器進行數字化后而成整數，然后進行電子存儲，以后數據可以調出顯示和進行分析。其優(yōu)點如下：

1、具有操作簡便，只要將染色的單個細胞推入儀器中，就會得出數據。
2、具有較高的靈敏度及測定速度，而且每次可測出許多數據，一般情況下，每秒可測5000個細胞，能迅速分析和記數大量細胞，并能準確統(tǒng)計群體中熒光標記細胞的比例。
3、應用廣泛，即可用于測定細胞活力、繁殖周期和細胞定型分析，也可區(qū)別死亡細胞、分裂細胞和靜止細胞群，既可測定DNA和RNA、測凋亡峰，又可測蛋白含量，特別是胞漿蛋白。
國內使用的流式細胞儀主要由美國的兩個廠家生產:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(簡稱B-D公司)。流式細胞儀主要有兩型:臨床型（又稱小型機、臺式機）和綜合型（又稱大型機、分析型）。ECKMAN-COULTER公司的產品為EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL等, B-D公司最新產品為FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是臨床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是綜合型，除具備檢測分析功能外,還具有細胞分選功能,多用于科學研究。

流式細胞儀

流式細胞儀主要由以下五部分構成:①流動室及液流驅動系統(tǒng)②激光光源及光束形成系統(tǒng)③光學系統(tǒng)④信號檢測與存儲、顯示、分析系統(tǒng)⑤細胞分選系統(tǒng)。

主要技術指標

1．流式細胞儀的分析速度：
一般流式細胞儀每秒檢測1000～ 5000個細胞,大型機可達每秒上萬個細胞。
2．流式細胞儀的熒光檢測靈敏度：一般能測出單個細胞上<600個熒光分子,兩個細胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分。
3．前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：前向角散射（FSC）反映被測細胞的大小,一般流式細胞儀能夠測量到0.2μm～０.5μm。
4．流式細胞儀的分辨率：通常用變異系數CV值來表示，,一般流式細胞儀能夠達到<2.0%,這也是測量標本前用熒光微球調整儀器時要求必須達到的。
5．流式細胞儀的分選速度：一般流式細胞儀分選速度＞1000個/秒，分選細胞純度可達99%以上。
? 主要構造和工作原理：流動室及液流驅動系統(tǒng) 編輯本段回目錄流動室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式細胞儀的核心部件，流動室由石英玻璃制成，單細胞懸液在細胞流動室里被鞘流液包繞通過流動室內的一定孔徑的孔,檢測區(qū)在該孔的中心，細胞在此與激光垂直相交，在鞘流液約束下細胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)。流動室里的鞘液流是一種穩(wěn)定流動，控制鞘液流的裝置是在流體力學理論的指導下由一系列壓力系統(tǒng)、壓力感受器組成，只要調整好鞘液壓力和標本管壓力, 鞘液流包繞樣品流并使樣品流保持在液流的軸線方向，能夠保證每個細胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而使激光激發(fā)的熒光信息準確無誤。流動室孔徑有60μm、100μm、150μm 、250μm等多種，供研究者選擇。小型儀器一般固定裝置了一定孔徑的流動室。

主要構造和工作原理：激光光源及光束形成系統(tǒng)

流式細胞儀可配備一根或多根激光管，常用的激光管是氬離子氣體激光管，它的發(fā)射光波長488ηm,此外可配備氦氖離子氣體激光管（波長633ηm）和/或紫外激光管。

流式細胞儀的主要測定信號熒光是由激發(fā)光激發(fā)的，熒光信號的強弱與激發(fā)光的強度和照射時間相關，激光是一種相干光源,它能提供單波長、高強度、高穩(wěn)定性的光照，正是能達到這一要求的理想的激發(fā)光光源。

在激光光源和流動室之間有兩個圓柱形透鏡，將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束(22μm×66μm)，在這種橢圓形激光光斑內激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細胞受照強度一致。

主要構造和工作原理：光學系統(tǒng)

流式細胞儀的光學系統(tǒng)由若干組透鏡、小孔、濾光片組成，大致可分為流動室前和流動室后兩組。流動室前的光學系統(tǒng)由透鏡和小孔組成，透鏡和小孔（一般為2片透鏡、1個小孔）的主要作用是將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束，使激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細胞受照強度一致，最大限度的減少雜散光的干擾；流動室后的光學系統(tǒng)主要由多組濾光片組成，濾光片的主要作用是將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管。濾光片主要有三類：長通濾片（LP）--只允許特定波長以上的光線通過，短通濾片(SP)-- 只允許特定波長以下的光線通過，帶通濾片(BP)-- 只允許特定波長的光線通過，不同組合的濾片可以將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管(PMT),如接收綠色熒光(FITC)的PMT前面配置的濾光片是LP550和BP525, 接收色橙紅色熒光(PE)的PMT前面配置的濾光片是LP600和BP575, 接收紅色熒光(CY5)的PMT前面配置的濾光片是LP650和BP675。

主要構造和工作原理：信號檢測系統(tǒng)

當測定標本在鞘流液約束下細胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)時產生散射光和熒光信號,散射光分為前向角散射（Forward Scatter, FS）和側向角散射或900散射（Side Scatter, SS）,散射光是細胞的物理參數與細胞樣本的制備（如染色）無關;熒光信號也有兩種,一種是細胞自發(fā)熒光它一般很微弱,一種是細胞樣本經標有特異熒光素的單克隆抗體染色后經激光激發(fā)發(fā)出的熒光，它是我們要測定的熒光,熒光信號較強,這兩種熒光信號的同時存在是我們測定時需要設定陰性對照的理由,以便從測出的熒光信號中減去細胞自發(fā)熒光和抗體非特異結合產生的熒光。
前向角散射（FS）反映被測細胞的大小,它由正對著流動室的光電二極管裝置接收并轉變?yōu)殡娦盘枺粋认蚪巧⑸浠?00散射（SS）反映被測細胞的細胞膜、細胞質、核膜的折射率和細胞內顆粒的性狀, 它由一個光電倍增管(PMT) 接收并轉變?yōu)殡娦盘?這些電信號存儲在流式細胞儀的計算機硬盤或軟盤內。
流式細胞儀測定常用的熒光染料有多種,他們分子結構不同,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異,選擇熒光染料時必須依據流式細胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長(如氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波488ηm,氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長633ηm）。488ηm激光光源常用的熒光染料有FITC（異硫氰酸熒光素）、PE（藻紅蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(葉綠素蛋白)、ECD(藻紅蛋白-得克薩斯紅)等。他們的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別是：
激發(fā)光波長（ηm）發(fā)射光峰值（ηm）
FITC 488 525（綠）
PE 488 575（橙紅）
PI 488 630（橙紅）
ECD 488 610（紅）
CY5 488 675（深紅）
PreCP 488 675（深紅）
各種熒光信號由各自的光電倍增管(PMT) 接收并轉變?yōu)殡娦盘柡蟠鎯υ诹魇郊毎麅x的計算機硬盤或軟盤內。

主要構造和工作原理：信號存儲、顯示、分析系統(tǒng)

(一) 信號存儲
存儲在流式細胞儀的計算機硬盤或軟盤內的數據一般是以List mode(列表排隊)方式存入的,采用List mode方式有兩大優(yōu)點:①節(jié)約內存和磁盤空間②易于加工處理分析。
（二）信號顯示和分析
由于List mode方式數據缺乏直觀性，數據的顯示和分析一般采用一維直方圖、二維點陣圖、等高線圖和密度圖。
1．單參數數據顯示和分析細胞的每一個單參數測量數據用直方圖來顯示，圖中橫坐標表示散射光或熒光信號相對強度值，其單位是道數，可以是線性的，也可以是對數的；縱坐標表示細胞數。一維直方圖橫坐標是FITC熒光信號相對強度值（對數），縱坐標表示細胞數;圖中已根據陰性對照設定適當的“門”（直線門），儀器的計算機就會給出測定值（包括陽性細胞%和平均熒光強度）。
2.雙參數數據顯示和分析細胞的雙參數測量數據和細胞數量的關系用一維直方圖、二維點陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。
3．三參數數據顯示和分析細胞的三參數測量數據和細胞數量的關系每兩個數據組成一對（三參數測量數據和細胞數量每兩個數據可組成6對數據）用一維直方圖、二維點陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。三個熒光數據關系用分光圖（prism）表示，分光圖可直接給出8個數據（如用ABC代表3種熒光，可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-）。
? 主要構造和工作原理：細胞分選系統(tǒng) 編輯本段回目錄如在細胞流動室上裝有超聲壓電晶體,通電后超聲壓電晶體發(fā)生高頻震動，可帶動細胞流動室高頻震動,使細胞流動室噴咀流出的液流束斷成一連串均勻的液滴, 每秒鐘形成液滴上萬個。每個液滴中包含著一個樣品細胞,液滴中的細胞在形成液滴前已被測量,如符合預定要求則可被充電,在通過偏轉板的高壓靜電場時向左或向右偏轉被收集在指定容器中,不含細胞液滴或細胞不符合預定要求液滴不被充電亦不發(fā)生偏轉進入中間廢液收集器中,從而實現了分選。

活體流式細胞儀(In vivo Flow Cytometer, IVFC)

活體流式細胞儀(In vivo Flow Cytometer, IVFC) 是一種新的生物醫(yī)學光學儀器，結合活體（近紅外）實時高速影像方法和體外流式細胞儀的概念，可實時檢測活體CTC并可以進行定量分析與檢/監(jiān)測，可用于實驗室對腫瘤治療效果的早期實時監(jiān)測及評估，藥物的早期篩選等。
IVFC技術原理是：帶有熒光標記的癌細胞在流動過程中經過放置于血管某處橫截面的一束激光，其受激發(fā)射的熒光信號通過光電轉換和模/數轉換在計算機中儲存，通過一段時間內檢測熒光信號來實時記錄循環(huán)系統(tǒng)中流過的癌細胞的數量。這種方法主要的特點是不用抽血，可在血管中檢測，屬于微創(chuàng)體內診斷方法。

浮游植物流式細胞儀利用流式細胞測量技術，在野外現場快速對水體中的浮游植物進行計數的儀器。與傳統(tǒng)的生物醫(yī)學流式細胞儀相比，具有如下顯著特點。
1）細胞粒徑范圍大，可測量0.4 um－4000 um間的浮游植物，幾乎覆蓋自然界的所有浮游植物粒徑范圍
2）檢測器強大，目前一臺標準的浮游植物流式細胞儀CytoBuoy配備6種檢測器：前向光散射（FSC）、側向光散射（SSC）、紅色熒光、綠色熒光、橙色熒光和曲度檢測器。可以對浮游植物進行分類。
3）堅固、耐用、輕便，適合野外現場測量，而傳統(tǒng)的流式細胞儀非常笨重，只能實驗室內使用。
4）樣品不需任何前處理，可以直接測量。傳統(tǒng)的流式細胞儀前處理復雜，處理不好就會阻塞管路。
5）不需外加鞘液，儀器自動采用水樣的濾液為鞘液，維護方便。
6）多版本可選。有便攜式機型CytoSense、在線監(jiān)測型CytoBuoy和水下型CytoSub。
7）可建立浮游植物專家?guī)欤蓪ψ匀唤缢畼又械奶攸c浮游植物（如易引發(fā)赤潮的硅藻和甲藻）鑒定到種，進行早期預警
8）新增成像功能，可拍攝特定細胞的顯微照片。

流式細胞術Protocal

一、樣品的制備

流式細胞儀是測定一個或重復的每個顆粒經光路的信號，因此，細胞必須做成單個細胞懸浮狀態(tài)，不能聚集，也不允許有細胞碎片存在。所用染料必須特異（如特異單抗），而且不允許滲透至載液中。
標本如果是屬于淋巴細胞等血細胞、骨髓細胞或白血病細胞系或類淋巴細胞系，要經Ficoll分離，作單細胞分離處理，但若為實體組織或貼壁生長的上皮成纖維樣細胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、膠原酶等)，化學法（EDTA、EGTA和檸檬酸鹽）消化分散液或洗液最好用無鈣、鎂PBS，檸檬酸鹽的濃度為40μmol/L，并同時采用機械分散法，將經消化處理的膨松組織，用玻璃珠懸搖或用吸管吹打分散均可，用PBS洗2～3次后重懸，最好過一下尼龍或不銹鋼網篩100μm和20μm。細胞濃度要保證在1-2×106/mL
若標本用于測定單個細胞，需加入1～5 mg/L的DNAase，將有助于阻止破碎細胞釋放的DNA造成細胞再聚集，但是若分離的細胞要作DNA含量測定之用時，則切勿加DNAase。
二、懸浮細胞的固定

上述制備的活細胞即可用于流式細胞儀分析，如果染色和流式分析要拖后進行，或為了提高染色效果，則要將細胞預固定。乙醇固定是常用的方法。
1、固定方法：
(1)甲醛法：在細胞懸液中加入等量的8%甲醛(用Hank'S液配)4℃下固定12-18小時。
(2)乙醇法：細胞懸于PBS中，緩慢加入-20℃預冷的95%乙醇，使終濃度為70%，冰浴30分鐘。
(3)丙酮法：于細胞懸液中，緩慢加入冷丙酮，使終濃度為85%。
2、實例：
(1)用預冷的無鈣、鎂含0.5mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液，將細胞制成1×106細胞的懸液。
(2)在4℃下逐滴加入3倍體積的95%乙醇，連續(xù)攪拌使乙醇終濃度達70%。
(3)該細胞可在4℃下保存數日。
(4)分析前先用1000r/min離心10分鐘，棄去乙醇，再將細胞懸于PBS中或要求的試劑中。
三、流式細胞儀分析的應用

(一)非染色細胞的光散射
一個粒子(如細胞)出現在一束光線中，立即會干擾該光束，造成該光束入射光的重分布，該細胞所獲能量則以衍散、折射、反射等復雜的參數形式重新發(fā)射出來，這些參數與細胞體積、表面構象、內部結構形成函數關系，可測低角前面約10°的光散射及90°的光散射。
一般認為，90°位置的光散射值主要受細胞內部結構所致的光反射和折射影響，而低角前面10°位置的光散射則主要代表細胞大小。光散射測量方法如下：
(1)將細胞懸浮于HBSS中，濃度介于1×106～2×106/mL濃度之間。
(2)以懸浮細胞平衡鹽溶液(HBSS)充滿含鞘液的細胞貯藏池。
(3)設定細胞流量為500個/S(秒)，以獲得最佳測定結果。
(二)染色法
1 細胞的碘化丙錠(propiolium iodide PI)染色
PI和EB(溴化乙錠)為同類物質，與EB一樣，PI嵌入DNA雙螺旋中，可使熒光強度增加約20倍，PI的熒光強度約為EB染色的1.8倍，以488nm波長激發(fā)，DNA/PI復合物最大的發(fā)射波長約為615nm。
1.1 小鼠Lewis肺癌細胞(3LL)DNA含量測定方法
(1)從C57BL/6小鼠上切除腫塊，在培養(yǎng)皿內用PBS沖洗；
(2)去除結締組織及脂肪，剪碎腫塊；
(3)小碎片移入1.20×38mm注射針,加壓使其通過,于4℃條件下重懸細胞于HBSS中。
(4)將200～300μL細胞懸液(5×105細胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL)，染色3LL細胞，于4℃存放20～30分鐘。
(5)測定580～750nm之間的發(fā)射熒光，以去除末結合PI產生的激發(fā)光與發(fā)射光譜線之間的重疊部分。
注：PI染色液：0.1%檸檬酸鈉1000mL+PI5mg+1%Nonide P40水。
1.2 培養(yǎng)細胞DNA的流式細胞儀分析
(1)從培養(yǎng)皿中吸去培養(yǎng)基，以HBSS沖洗二次；
(2)加入PI5mL于培養(yǎng)皿中，在4℃放10分鐘；
(3)用吸管反復次打細胞，使細胞破壞，胞核釋放出來，再行流式細胞儀分析。
1.3 完整細胞DNA的PI染色
(1)70%乙醇固定的細胞懸液，離心，去固定液；
(2)室溫條件下加入PI染色一批細胞（105～106細胞/mL），時間為30分鐘，然后行流式細胞儀分析。
1.4 光輝霉素和PI的DNA染色
在熒光抗生素光輝霉素和PI聯合染色過程中，光輝霉素的供體分子被PI的受體分子接受產生能量轉移，該染色技術主要用于實體腫瘤組織，精子細胞及婦科標本，同時也適用于體外培養(yǎng)的細胞。
(1)分離制備的細胞懸液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。
(2)以PI/光輝霉素染色，4℃1小時（PI為10 mg/L、光輝霉素為10 mg/L）。
(3)染色后進樣，以100W汞燈作為激光光源，使用BG123nm阻斷濾片，疊加K590型高通濾法(one seep filter)。
2、DNA和RNA的鑒別染色
利用吖啶橙的變色特性可鑒別DNA和RNA。吖啶橙作為一種熒光染料已被用于染色固定，非固定細胞核酸，或作溶酶體的一種標記。觀察死亡細胞熒光變色性變化以及區(qū)別分裂細胞和靜止細胞群體。雖然測定DNA和RNA含量時較難獲得好的重復性結果，但該方法已被許多實驗室廣泛采用。方法如下：
(1)試劑：
溶液A：低溫保存，穩(wěn)定期約2周。
Triton X-100(0.1%) 0.1mL，1mol/L HCL 8mL
1mol/L NacL 15ml蒸餾水76mL，PH1.5（100mL）
溶液B：穩(wěn)定期數月，最好除菌以后(高壓或過濾)貯存。
0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L Nacl15mL
0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L檸檬酸18.5mL
蒸餾水24mL，總體積為99mL pH6.0
吖啶橙母液：
用吖啶橙/蒸餾水配成1mg/mL(致癌物，應小心)，吖啶橙應用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀釋。
注意：儀器鞘流系統(tǒng)應保持4℃。
氬激光激發(fā)波488nm，紅色熒光為DNA(F>600nm),綠色熒光為RNA或單鏈DNA(F>530nm)
(2)方法
①用含15%血清的PBS配制細胞懸液，取0.2mL(8×106細胞/mL)，加入0.4mL溶液A，4℃放置45～60秒。
②加1.2mL含吖啶橙的溶液B，室溫2分鐘。
③應在加入溶液B后10分鐘內進流式細胞儀分析。
注意：①細胞數保持恒定；②核酸與吖啶橙的比例；③染色時間及溫度。
(三)染色法的應用
1、變性及雙鏈DNA的鑒別染色
(1)試劑：
HBSS內含1000u/mL RNA酶A，0.2mol/L KCl pH1.35
吖啶橙用0.1mol/L檸檬酸配成5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4緩沖液，pH2.6。
①2×106細胞懸于1mL HBSS/RNase液中。
②37℃溫育1小時。
③將0.2mL細胞懸液(含4×105細胞始終懸浮于HBSS/RNase)與0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混勻，20℃ 30分鐘。
④加2mL吖啶橙染色2分鐘。
⑤綠色熒光(530nm)和紅色熒光(600nm)分別代表細胞中單鏈及雙鏈DNA含量。
2、DNA與癌基因探針雙標記測定
這種測定是先用癌基因探針按間接免疫熒光染色法標記癌基因表達產物，然后用PI標記DNA，現以研究白血病細胞增殖與癌基因的關系說明操作步驟：
(1)制備白血病細胞懸液，用100%甲醇在-20℃固定10分鐘。
(2)取50μl50 mg/L的癌基因探針Y13-25(它是一種廣譜單克隆抗體，可特異性地直接與N-ras，Ki-ras和Ha-ras三種癌基因編碼的21Kd蛋白相結合)，4℃作用30～45分鐘。
(3)用PB離心洗滌2次，重懸浮于50μL HBSS中(含0.1%疊氮鈉和2%小牛血清)。
(4)加入50μL 1:200兔抗鼠IgG，4℃放置30～45分鐘。
(5)同(3)洗滌后加入50μL 1:40的FITC標記的羊抗兔IgG，4℃反應30～45分鐘。
(6)同(3)洗滌后，細胞用RNA酶消化，室溫20～30分鐘。
(7)同(3)洗滌后，用PI染液染20分鐘。
(8)同(3)洗滌后，用488nm激發(fā)波長測定。FITC染色顯示ras癌基因表達產物，PI染色顯示DNA含量。
注意事項：
①制備樣品時，離心次數不宜過多，防止細胞丟失和凝集；
②細胞固定時間不宜過長，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定劑；
③為了降低本底，應將細胞表面未結合的熒光染料洗凈；
④進行雙標記沉淀時，應盡量選用激發(fā)光譜不接近的熒光色素。
3、以溴化脫氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料進行細胞周期分析。
(1)試劑：
用培養(yǎng)基配制33 mg/L Brdu及脫氧細胞苷26.4g/mL。
染色液：Hoechst33258溶于PBS，細胞染色24小時后進行分析，據報道染色的穩(wěn)定時間在30分鐘至24小時之間。
(2)方法：
①將Brdu溶液按1:10加入細胞培養(yǎng)液中。
②根據細胞周期時間不同，選擇不同時間培養(yǎng)的細胞。
③孵育后，搖散細胞以傳代培養(yǎng)。
④直接用染液重懸細胞，進入流式細胞儀分析。
Hoechst33258熒光值在410～580nm之間，需用330～360nm紫外光激發(fā)。應特異性結合腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對。因此，不僅特異性標記DNA，亦可標記胸腺嘧啶。在細胞周期分析時，在與細胞孵育過程加入Brdu,Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶，因此，處于合成期內的細胞表面上仍保持二倍體狀態(tài)，并在分裂后G1峰的半峰處產生一新峰，此項技術可用于直接測定細胞G2期及分裂時間。
4、Hoechst33342染色活細胞DNA
(1)試劑：Hoechst 33342,用蒸餾水配成0.25mol/L。
(2)方法：
①制備106/m細胞懸液，以Hoechst33342染色，濃度為5～10 mg/L ，室溫下20分鐘。
②分析前切勿洗滌細胞。
Hoechst33342可用作細胞DNA的活體染料，據信可在保持細胞活性的同時，呈現出相當好的DNA化學計量關系，激發(fā)波在紫外范圍350～363nm之間，發(fā)射波則在450nm處。
5、以異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyante FIFC）染色蛋白質。
(1)試劑：異硫氰酸熒光素(FIFC)用含40 mg/L RNase的PBS配成0.1～1.0 mg/L濃度。
(2)方法：
①染色前用終濃度70%乙醇固定細胞，至少18小時。
②離心固定細胞，棄去固定液。
③室溫下用FIFC染色細胞蛋白，30分鐘。
④流式細胞儀分析，使用氬激光，激發(fā)波長488nm，熒光發(fā)射波長515～535nm。
也可于固定細胞中，以18 mg/L (0.1%檸檬酸鹽配制)和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分鐘以上可對DNA和蛋白質雙重染色，分別呈現紅色熒光（DNA）和綠色熒光（蛋白質）。
6、熒光素抗體的應用
該技術既可用于檢測帶有特異性膜抗原的細胞，可用熒光素或若丹明標記單克隆抗體處理上述細胞；也可用于測定胞漿中的蛋白質(如凋亡BCL-2蛋白，抗病毒蛋白MXA等)。
用磷酸鹽緩沖液Eagle's MEM稀釋FIFC連接的抗體內含0.1%疊氮鈉、2%牛血清。為判定FIFC抗體的最適度的稀釋濃度，向微量滴定板的細胞中加入50μL不同濃度的稀釋液，再以熒光顯微鏡確認最佳染色濃度。使用抗人LEU-I抗體分析時，應稀釋成5 mg/L或 0.25 mg/L。無論鼠或人細胞在2×107濃度時其存活率應在90%以上。
方法：
(1)于微量滴定板加入50μL抗體稀釋度，再加入50μL細胞懸液，混勻。
(2)冰浴45分鐘，離心滴定板（1500r/min 10分鐘）。
(3)棄上清，以培養(yǎng)基100μL洗滌細胞沉淀2次，每次洗滌后用1500r/min 10分鐘，棄上清。
(4)以1ml預冷的培養(yǎng)基配成1×106細胞/mL的已染色細胞懸液，進樣前持續(xù)保持冷環(huán)境(4℃)。

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